安徽快三手机版助手—不同的抗原修复液和修复方法对免疫组化染色结果的影响【精品文档】

530第31卷第5期2013年10月广东医学院学报J 01 7RN AL 0F G U AN G D O N GM 匣D I CAL CO LLEG E、厂01．310ct．2013N O ．5安徽快三手机版助手—不同的抗原修复液和修复方法对免疫组化染色结果的影响刘小燕1，杨广东佛山528000；2。广州安必平医药科技有限公司，广东广州510665)鉴2，陈莹1，范菊花1，周东华1，平静1(1．广东省佛山市妇幼保健院病理科，摘要：目的探讨不同抗原修复液及不同修复方法对免疫组化染色结果的影响。方法选用CD20、CD79a、Cycl i nD1、Bcl ．2、Ki ．67抗体及人扁桃体组织进行免疫组织化学检查，修复液分别使用0．01 m oL／L柠檬酸( pU6．o)、l m m oL／LED TA( pH8．O )、o．05％柠康酐(pn 7．5)、1rnm oL／L Tri sED TA( pH 9．O )、O ．01m m oL／L Tri sBuffer( pH7．6)、O ．01m oL／L PBS( pn7．4)、Protease。修复方法分别为室温修复15 d、70。C修复30 rai n、70' E修复4 h、100。C修复30 m i n、高温高压修复2rai n。安徽快三手机版助手结果采用0．01 m oL／I带檬酸(pn6．0)、1 m m oL／LED TA( pH8．0)、1 m m oL／L Tri sED TA( pH9．o)、0．05％柠康酐(pn7．5) 修复液1000C及高温高压修复方法比采用其它修复液及修复方法效果好。安徽快三手机版助手结论温度、抗原修复液的pH 值、离子浓度等都会影响抗原修复。关键词：免疫组织化学；抗原修复；高温高压修复中图分类号：R446．6文献标识码：B文章编号：1005-4057(2013)05．0530．02DO I：10．3969／j ．i ssn．1005-4057．2013．05．013免疫组织化学与砸染色相结合，是最重要的辅助病理诊断的方式之一，但多数组织在经福尔马林固定后其抗原与抗体结合的亲和力下降或者抗原性完全丧失。为寻找可以替代福尔马林的组织固定液，取得理想的染色结果，近年来抗原修复技术被广泛应用于免疫组织化学检测。本研究对不同抗原修复液和修复方法对免疫组化结果的影响进行比较，以期探索比较理想的抗原修复方法。1材料和方法1．1材料组织块选用人扁桃体组织，10％中性福尔马林固定，石蜡包埋。所有检测都用同一块扁桃体组织，组织切片厚度2肚m ，将组织切片裱片在用多聚赖氨酸涂膜的防脱玻片上。1．2试剂用于免疫组织化学检测的抗体CD20、CD79a、Cycl i nD1、Bcl ．2、Ki ．67以及DAB和DAB缓冲液均购自美国Cel lM arque／z涧，上述5种抗体均为鼠抗人单克隆抗体。二抗是来源于美国Cel l M arqu硷司的非生物素多聚过氧化物酶。抗原修复液在安必平免疫组织化学试剂研发室制备，包括0．01m oL／L柠檬酸( pn6．0)1m m oL／LED TA( pH8．o)、0．05％柠康酐( pH 7．5)、l m m oL／L Tri s ED TA( pH9．O )、0．01m m oL／L Tri sBuffer( pn 7．6)、O ．01m oL／LPBS( pH 7．4) 、Protease从美国Cel lM arque公司购进。1．3仪器设备顺发牌高压锅、美的家用电磁炉、上海新苗恒温水浴收稿日期：2013．06-17；修订日期：2013-09-16作者简介：刘小燕( 1982一) ，女，本科，技师。箱。安徽快三手机版助手1．4免疫组织化学染色步骤( 1) 常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化组织片；( 2) 将切片浸在3％H 202中10m i n，蒸馏水冲洗3 rai n× 3次；(3)力Ⅱ入一抗，25。C孵育30 i ／fi n；(4)用PBS冲洗3 m i n× 3次；( 5) 加入100斗L二抗增强剂，室温孵育10 m i n；( 6) 用PBS冲洗3 m i n× 3次；( 7)加入100I．LL二抗．H RP聚合物，室温孵育10m i n；( 8) 用PBS冲洗3 m i n× 3次；( 9) DAB染色3m i n；蒸馏水浸泡终止反应；(10苏木素复染，蒸馏水返蓝，脱水，透明，封片。安徽快三手机版助手结果判定：阳性染色为棕黄色颗粒，CD20、CD79碇位于细胞膜，Cyel i nD1、Ki ．67定位于细胞核，Bcl ．2定位于细胞膜或细胞浆，阳性细胞数占0％为( 一) ，1％～10％为( +) ，11％～50％为(++)，5l％～80％为(卅)。安徽快三手机版助手1．5抗原修复方法( 1) 室温修复：将片子浸泡于不同的修复液中15d。安徽快三手机版助手(2)70℃抗原修复30 m i n：组织片浸泡于抗原修复液中，用有温度控制的加热蒸汽装置热修复，修复时间是温度达到70℃后持续30 m i n。( 3) 70℃抗原修复4 h：组织片浸泡于抗原修复液EDTA中，用有温度控制的加热蒸汽装置热修复，修复时间是温度达到70。C后持续4 h。( 4) 100。C抗原修复：组织片浸泡于抗原修复液中，用有温度控制的加热蒸汽装置热修复，修复时间是温度达到1000C后持续30 m i n。( 5) 高压抗原修复：组织片浸泡于抗原修复液中，用民用电磁炉和高压锅加热，在喷气后持续2 m i n( ED TA) 或2rai n30s(柠檬酸)。2结果免疫组化染色组织切片结果显示，采用0．01 m oL／L柠檬酸( pH6．0)、1m oL／LED TA( pH8．0)、O ．05％柠康酐(pn 7．5)、万方数据 第5期刘小燕，等．安徽快三手机版助手—不同的抗原修复液和修复方法对免疫组化染色结果的影响53 11 m m oL／L Tri s ED TA( pH9．0) 修复液100。C及高压修复方法比采用其它修复液及修复方法效果好，见表1。表1不同抗原修复液与修复方法免疫组化染色结果比较修复液抗体修复方法—i ——i ——丁—1F—i —i —石CD 20Cyel i nD lKi ．67++一+++一+++++++一一一一+++一一一一一+++++++++++++一一++++++++++++++一一+一一一一一一十+一一一一一一++++一一一一++一++一一一(2)一十+一一一一一(3)一++一一一一一(4)++卅卅卅+一一( 5) ++++++++++++++一CD 79a(1)一+一+++一(2)+-．Far一一一一一(3)● D ++++++++++++( 5) +++++++抖+++一++一一一一一一一一++一Bcb2(1)一一一一一一一(2)一一一一一一一(3)一++一一一一一(4)++++++++一一一(5)++++++++一一一修复液：A，0．仇m oL几柠檬酸(pa 6．O )；B，l m m oL／L ED TA0H8．0) ；C，0．05％柠康酐Q H7．5)；D，lm m oL／LTri sED TA0H9．0)；E，O ．01m m oL／LTri s Buffcr( pH7．6)；F，0．01m oL／LPBS( pH7．4) ；G，Protease。修复方法：( 1) ，室温15 d；(2)，706C30m i l l ；(3)，70"(24 h；(4)，100。C30 rai n；(5)，高压2 rai n。3讨论免疫组织化学结果的判断取决于免疫组织化学切片的质量，从组织标本的固定到切片染色的全过程都会影响到免疫组织化学切片的质量l l J 。抗原修复是免疫组化操作技术中的关键步骤，抗原修复方法是否得当，直接影响抗体的表达。影响病理诊断的准确性和患者治疗方案的选择¨ 1。加热抗原修复(heat-i nduced．anti gen retri eval ，AR) 技术是免疫组化( i m ．m tm ohi stochem i stry，m C)发展史上的重要里程碑” 。，通过热修复的方法打破封闭的抗原决定簇中的交联结构．使被封闭的抗原重新暴露，以提高免疫组化染色结果的阳性表达率。该技术既能保留福尔马林固定石蜡包埋组织良好的组织学形态，又明显提高抗原的检出率。高压加热法能把被掩盖或交联变性的抗原暴露或修复，使免疫组化的结果更准确可靠H 。Shi 等p1认为抗原修复时，加热的温度与加热时间成反比，只要达到一定的温度和时间，抗体表达效果不应该出现问题。本研究发现70。C温度修复多数抗体存在修复不够，其表达弱于l O O T；和高压修复，延长组织片在700C ED TA修复液的时间4 h，其抗体的染色强度与100。C修复30 m i n相似。热能的来源对抗原修复的影响是可以控制的，不管何种热源只要通过系列测试可以发现最适合的条件。在所有用室温进行抗原修复了15 d的组织片，除CD20有胞膜表达，其余抗体都无表达，证明即使有化学物质，有适宜的pH 和缓冲液，如果没有热能的驱动，其组织中的抗原性得不到有效的恢复。影响抗原修复效果除了温度和修复液的pH 值外，修复液的成分是影响抗体表达效果的另一重要因素。多数抗体在用Tri s Buffert努复的组织中不表达或表达明显削弱，说明修复液中适宜的化学成分与离子浓度和修复有关。综上所述，只有抗原修复液，没有温度的影响，不能使多数抗原修复。只有温度，没有合适的抗原修复液参与修复，抗原修复也不够。不同的温度可能对修复的强度有影响，抗原修复液的PH 值、离子浓度等都会影响抗原修复。绝大多数抗体须经热修复来提高免疫组化的敏感性，其染色结果要强于不修复，尤其是胞核、胞膜抗原的修复均须高温、高压修复。参考文献：[1】李飞虹，高嵋．研究生应用免疫组化技术的质控与标准化【J 】．广东医学院学报，2008，26(2)：218—220．[2】骆新兰，林兴滔，罗东兰，等．pH 9．0不同成分的抗原修复液对免疫组织化学染色结果的影响[J 】．中华病理学杂志，2012，41(3)：192．194．[3】J agi rdar J ．Im m unohi stochem i stry：thenandnow [J 】．ArchPathol LabM ed, 2008，132(3)：323-325．[4】郭丽，祁荣，吴鹏．安徽快三手机版助手—不同的抗原修复方法在免疫组化染色中的应用[J ]沈阳医学院学报，2012，14(3)：152．153．[5】Shi S R，CoteRJ ，Tayl orCR．Anti genretri evaltechni ques：currentperspecti ves[J ]．J H i st ochemCytochem ，2001，49(8)：93I-937．㈦@@@6nQ侣似佑n万方数据 精品资料，你值得拥有！