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内容提示: Y 769876後旦大学博士学位论文学校代码:10246学号:021101021$G T促凋亡作用及Cydi nD 3与VD R相互作用对其转录调控的影响研究院专系:业:黝麟与脚予翠掣顾建新警授圭兰竺兰堕姓名:指导教师:完成日瓤一攀呼哆叩 复星大学2005蒜薅士毕蛙论文中文摘要第一部分SG T的促凋亡功麓研究1990年最早在酵母细胞CDC蛋白中发现的TPR潦序,是一个包含34个具有麓荠性氨基酸残基的多肷煎复序列,它介导了多种生物学过程,比如缨胞周期控麓、转录撩潮、蛋自质折叠、蛋白覆运输矛【l 神经发生。SO T是含有TPR基序蛋巍质家族的~员,1998年被证实能够与细小病毒H 1的非结构蛋白N Sl 相互...

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极速快三技巧网—官方网址22270.COMY 769876後旦大学博士学位论文学校代码:10246学号:021101021$G T促凋亡作用及Cydi nD 3与VD R相互作用对其转录调控的影响研究院专系:业:黝麟与脚予翠掣顾建新警授圭兰竺兰堕姓名:指导教师:完成日瓤一攀呼哆叩 复星大学2005蒜薅士毕蛙论文中文摘要第一部分SG T的促凋亡功麓研究1990年最早在酵母细胞CDC蛋白中发现的TPR潦序,是一个包含34个具有麓荠性氨基酸残基的多肷煎复序列,它介导了多种生物学过程,比如缨胞周期控麓、转录撩潮、蛋自质折叠、蛋白覆运输矛【l 神经发生。SO T是含有TPR基序蛋巍质家族的~员,1998年被证实能够与细小病毒H 1的非结构蛋白N Sl 相互作用的礞白,后来的研究表明生长激素受体、TG F[ 3超家族的M yostati n和H IV的Vpu溪自遣霹有稳夏{睾窝,瑟在突舷囊逮表鬣CsD/H scTO /SO T形藏分予毒睾毽菱舍爨势表现出一种依赖ATP的分子伴侣活性,这种活性极钶可能与突触传递有关,在线虫中用RN Ai 抑制SG T表达可提高H sc70的分子伴侣活性从而导致B样淀粉肽越裘达的线虫转基因模型中淀粉样斑块明艘减少。两最避的一顼研究滚明SO T在缎耱有丝分裂中有一定俸嗣,僵其分子枫铡尚不疆确。极速快三技巧网—官方网址22270.COM近年来一些TPR蛋白如CH IP、Strap和Tpr2等被发现参与了细胞凋亡信号通路,提示SO T可能也有类似的功能,本研究则提供柯力的证据表明SG T是具有程疆亡淫瞧戆。我羹善宠慈立了SO T越袭达懿稳定缀憝猿,接下鬟乏瓣寒诱导缎嚣餐凋亡实验结聚显示SM M C一7721细胞中超寝达SG T可以加速细胞凋亡并表现出细胞核碎裂等细胞凋亡特征;分别用CH X和STS诱导细胞凋亡的过程中,SG T的m RNA求平也毒~定程度舞嵩;用RN Ai 技术下调SG T的瞧澡性表达可减少纯学匿予弓i 发的细胞凋亡。极速快三技巧网—官方网址22270.COM缺失突炎分析表明SG T的TPR结构域对于SG T的促凋亡活性麓必要的。进一步研究表明在SM M C一772l 细胞中超表达SG T并不改变细胞增殖和细胞周期,不仅如此,超表迭SG T所致的细胞凋亡过稷中伴随有PARP的剪切和细魏色素e兹鼯骏,豆可被广港鲍Caspases蘩毒l 裁掰李霉毒l ,表鞠獒璃亡途径是线粒体依赖的。已知H sc70可以保护有DAN 损伤、紫外辐射、血清饥饿和一些化学药物引起的细胞凋亡,且这种促凋亡功能是依赖其分子伴侣活性的,考虑到SO T可以调控H sc70鳃分子俘稻活性,凌镅在绥艟中超表达H sc70,然藤结果显示它并不能阻止SO T的促凋亡活性,嚣此表鹳存在另外的僖号途径分导了这一生物攀过程,本室以文,l 。极速快三技巧网—官方网址22270.COM为诱饵进行酵母嵌杂交的方法筛导了一些凋亡相关蛋白Pi Abt、H sp90和Bcl 2L12可能有鼬与阐明SG T馁凋亡机制。关键词:SG T,H scT0,凋亡,TPR,RN Ai ,线粒体 复垦大学2。极速快三技巧网—官方网址22270.COM05弱瓣± 事、监谂文第二部分Cycl i n D 3与vD R相互作用及对转录调控的研究静息黼细胞在丝裂原的刺激下,编码D型细胞周期蛋白( cycl i n D) 的基因被激活,然后通过与CDK4溅CDK6结合并激活他们的激酶活性,活化后的Cdk4和Cdk6可以磷酸化pRb,pRb蛋白被磷羧化后,转录因子E2F激滔S期基因的液达反面诱警绸胞周麓静继续进行。近泉的研究表明D蓬Cycl i n通过和多静转泶因子相互作用并且调节它们的活性,并且这种调节多为CDK非依赖的。通过酵母双杂家鉴定了一个Cycl i n D3的相互作用蛋白VDR并在酵母和体外豹G ST—PU LLDO W N 孛证实了二老弱程嚣搏滔,萁中VDR霪予孩受锩怒家族审翡一员,当它结合l ,25一( oH ) 2-vi tam i n D3后就可以和RXR形成异源二聚体,然后结合到靶基因的VDRE上,通过和一些转录共激活子的协同作用并对其转录活性谶萼亍调控。本磺究鲍实验结杀表骧Cycl i n D3在体内可戳帮VDR攘§ 俸震,并且送稀作霜只在vi tam i nD3憝理后才表现躺比较明显。极速快三技巧网—官方网址22270.COM德EM SA的实验结果却显示怒表达Cycl i n D 3并不改变VD R与对应的VD RE的结合能力。极速快三技巧网—官方网址22270.COM而Cycl i n D 3的能和VDR相互作用的突变体才能上调VDR的始录活性,同时VDR的几个突变体转入细夔磊菝告蒌颡懿活毪穰羝,遴一多表鞠了Cycl i n D 3程逡转交滔往是茯蔟VD R的。我们还构建了特异性的si RN A Cycl i n D3载体用以迸一步阐明其生物学功能;以前的报福建快三技巧 —首页-表明Cycl i n的转录调控功能大多数是不依赖其对应的CDK激酶活性,霆戴我翻麴建了三令突变菇,分别是Cycl i n D 3点突变嚣丧失了与CD K的结合能力,CD K4和cD K6则失去了蕊激酶活性,以验证Cycl i n D 3调节VD R的转录活性摄否依赖CDK4和CDK6。极速快三技巧网—官方网址22270.COM关键弼:Cycl i n D3,VDR,l ,25( oH ) 2一D3,转录调控 复旦大学2005菇媾士毕业论文AbstractPart I:The research of the i nvol vem ent of SG T i napoptosi sT}玲tetratri copepti de repeat( TPR) i sw hi chi sfi rstdi scovered i n CD Cprotei n ofadegenerate34一am i no aci d repeat m oti fyeast.Thi sm oti fi s w i despread i nevol uti on and i s i nvol ved i n avari etyof cel l ul arprocesses.SG Ti s a m em ber of suchTPR m oti f protei n fam i 甄w hi ch i sfi rsti denti fi edasabi ndi ng partner ofthenonstrucnxral protei nN Slw ere al so f ound to i nteract w i thSG T.H ow ever, i naCaenorhabdi ti sel egansm odel forAl zhei m erdi sease,SG Tm aybei nvol vedof parvovi rus H -1.N ext,G H R,M yostati nandVpuprotei ni n13-am yl oi dpepti de- dependentpathogeni ci tyi nthi s m odelsystem .O n the other hand,r斑SG ,r prom otedthechaperone acti vi ty of H sc70 i nprotei n( Csp) andH sc70,w hi chi sthoughttoparti ci patei n vesi cl e· m edi ated neuronalsi gnal transducti on。M ost recentl y, a cel l ul ar fancti on of SG T w as associ ate w i 魄atri parti te com pl ex contai ni ngthe cystei ne stri ngm i tosi s.Inthi sstudyw ereportedthat SG Tpl aysarol e i n apoptoti c si gnal i ng.Ectopi cexpressi onof SG T enhances D N Afragm ent and nucl eusbreakage after the i nducti onof apoptosi s+Thei ncrease of SG T m RN Ai s al so observed i n 7721 cel l sundergoi ngapoptosi s,knockdow ntheexpressi onofendogenousSG T contri butes to the decreaseof ape’ ptosi sof 7721 cel l s.Del eti onanal ysi sreveal s that TPR dom ai n i s cri ti calproapoptoti cfuncti on of SG T.Fum l eH nor。.w e dem onstrated that thePARPcl eavageandcytochrom ec rel ease are enhanced w hen SG T i s overexpressedi n 7721 cel l sduri ng apoptosi s.Consi deri ngthat SG T canregul atethechaperone acti vi tyof H se70w hi ch canprotect cel l apoptosi s,w ethereforespecul atedw hether thepm apoptoti con H scT0。H ow ever, t o ourtoacfi vi tyoverexpressi onof H sc70 coul d not i nhi bi t theproapoptoti c acti vi tyof SG tKey W ords:SGT, H sc70,apoptosi s,TPR,RN Ai ,m i tochondri aofSG Ti sdependentdi sappoi ntm ent、 复旦大学2005籀博士毕韭论文Part II:The research of the i nteracti on ofCycl i nD 3 w i th VD Rand i tstranscri pti onal regul ati onfuncti onD —type cycl i nsare essenti aI for theprogressi on throughthe G lphaseof the cel tcycl e.Fol l ow i ng m i togensti m ul ati on ofqui escent cel l s,D -type cycl i ns get acti vatedat thebegi nni ngof the 01phase,w hi chthenki naseacti vi tyof theseprotei nsand thenphosphoryl atethe cdktarget protei nssuch asRb,w hi ch i s the necessary for the Grl /S transi ti on.Besi des servi ngbi nds Cdk4 or Cdk6 to acti vate theaseel lcycl eregul ators,D —type cycl i nsw eTereportedto havetranscri pti on regul m i onfuncti onsthrough i nteracti on w i th several transcri pti on factors.O ur previ ousresul ts show edthatCycl i nD 3 i s a newi nteracti ng partnerof Vi tam i n DReceptor( VDR) ,am em berof thesuperfm ni l yof nucl earreceptors.Inthi sstudythi s i nteracti on w as strengthenedi n RO Sl 7/2.8 cel l s treated w i th1.25一di hydroxyvi tam i n D 3加vi vo.U si ngthe del eti onm utati on of VD R andCycl i nD 3 to check thei rtranci pti onal acti vi ty respecti ve玟w ef ound thattheupregul ati on of osteoeal ci n prom oteracti vi ty byCycl i n D 3i sdependentonVD R.H ow eveL Cycl i nD 3 di d not affect thebi ndi ng abi l i tyof VD R tothe VD RE of osteocl aci nprom oter.Tofu犍l eri nvesti gatedthe fi m cti on of theCycIi nD 3i ntranscri pti onalcontrol ,w econstructedaspeci fi caIsi RN ACycl i nD3,furtherm ore,to cl ari fyw hether thetranscri pti onal regul ati onfuncti on ofCycl i nD 3 i son CD K,W e constructed the ki nase deadpl asm i dsof both CD K4 andCD K6andam ut at i onof Cyct i nD 3thatl osti tsabi l i tytobi ndw i thCD K.dependentKey W ords:Cycl i nD 3,VDR,1,25( O H ) 2一D3,transcri pti onalcontrol 复旦大学2005鼹媾士毕业论文第一部分SG T促凋亡功能的研究刖蟊细胞凋亡( Apoptosi s) ,又称程序性细胞死亡( Program m edCel l Death,PCD) ,是多细胞生物为调控机体发育,维护内环境稳定,且由基因控制的细胞主动死亡过程。细胞凋亡可以发生在不同的细臌系中,著且由蕾年多包内或臌外鲍刺激信号掰诱导,这魏鞠激信号髓够在细麓内澈活特异蠖豹蠢杀税裁,其中钰括:¥辐鸯雩,营养因子撤退,基因毒性药物,抗感染、抗癌药物放蛋白合成抑制剂f1邓】。在一般意义上讲,凋亡是由箕形态特征来定义的,在光学最微镜和电子显微镜下可观察囊缨魏蠲亡戆葵鍪跨鬈,嚣孩霾绩,麓覆浓缭,绥麓钵撩急裁变小;菝俸获缀小,核仁消失;DN A在核小体连接她断裂成核小体片段,并向核膜下或中央鄱异染色质区聚集,形成浓缩的染色质块,染色质聚集区以外的低电子密度区为谶明区,它爨漆予核孔变大嚣导致逯透馕罐大,胞震中的拳蠹}不叛渗入两形成蛇。极速快三技巧网—官方网址22270.COM隧螽透羁嚣不断扩大,染色质迸一步凝集,孩膜在梭膜孔处断裂并包裹,形成游千由质膜包凝的核碎片,即凋亡小体,它很快被巨嘴细胞和邻近细胞识别、吞噬和消化,但并不影响其它纲胞的正常功熊,其与病趱性吞噬最大的区别是没有形成炎疰反瘦;嚣在另癸一黧豹秘静中,矫赛嚣子雩|越戆缀憝稠亡舞憝少经龚瑟缨麓凋亡形态特缎,比如损伤性缺血、发育过程中f4】。极速快三技巧网—官方网址22270.COM在分子水平,凋亡过程激活了一个进化上保守的蛋白酶家族Caspases( Cystei neAspartyl .Speci fi c Proteases) ,人类基因缌缡玛鸵Cazpases毒l l 或12个( Fi gure 1) ,Caspases在正常的生邋条件下以酶琢的形式存在,在外界因子激活细胞内凋亡信号通路的情况下,他在保守的Asp处被切掉一个短肽后激活,此后弓l 起一系列的级联反废,当最终的效应Caspases被激活后耀予相应的底物获嚣发挥羹葫薤[5, 6, 7, 8t;葵佟矮豹疯麓魏括:蛋鑫激懿、萁谴绩号途径中戆蛋囊、细胞骨架和核基质蛋自、染色质修饰酶( 如PP。极速快三技巧网—官方网址22270.COMRP,pol y( ADPfi bese) poL_vm erase) 、DN A修复蛋臼、内切核泼酶的抑制亚单位( CIDE,cel l death-i nduci ngDFF45.1i keeffector) 。极速快三技巧网—官方网址22270.COM瑟在某些病理袋馋下,Caspases农葵毽黪凝鑫质网络( 魄翅cal pai ns) ,使得凋亡信号途径变得更加复杂{9,l “ 。 复旦大学2005届博士毕业论文Fi gurehum ancaspases i spresented.The prodom ai ns of theupstreami ni ti ator caspasesi n the dow nstreameffector caspases.Aspartyl resi dues at w hi chproteol yti c1.Caspase fam i l ycel ldeathproteases.The dom ai n archi tecture oftheareabsentprocessi ngCaspase一2can be rem ovedby cl eavage atw hereas theprodom ai n ofpro—Caspase- 9rem ai ns i ntact.处在凋亡信号网络中的蛋白质,他们往往通过一些保守的结构域在相互识别从而实现信号的传递。极速快三技巧网—官方网址22270.COM这些保守的结构域包括:①CARD( the caspase—associ atedoccurs and theacti ve—si te cystei neal e i ndi cated.The prodom ai n ofal lasparti c aci d resi due( notshow n),recrui tm ent dom ai n) 结构域:②D ED ( the death effector dom ai n) 结构域;③D D ( the death dom ai n) 结构域;④IAP蛋白( m eBI R dom ai n ofapoptosi s) ;⑤BH ( theBcl 一2hom ol ogyBHdom ai ns of Bcl 一2fam i l y protei ns) 结构域。上述网络形成的信号决定了某些特定的凋亡效应分子激活从而导致细胞凋亡,这包括前面提到的Caspases蛋白家族和含有CIDE结构域能促凋亡的核酸内切酶。除了上面提到的7个构成凋亡信号核心网络的结构域以外,尚有一些含有特定机构域的蛋白质家族也被发现在凋亡信号通路中发挥了重要的『f用,这包括有:①TN F蛋白家族受体( tum or necrosi s( TN FRs) ;③TIR结构域( tol l and IL- 1receptor dom ai ns) ;④pyri n结构域,也称PAAD ,forpyri n,AIM ( absent—i n- m el anom a)i nhi bi toroffactor fam i l y l i gands②TN F受体(,ASC(apoptosi sassoci atedspeck—l i kedom ai n] ) and DD—l i ke];Pyk;or D APIN ( dom ai ni napoptosi sand i nterferonresponse)protei ncontai ni ngaCARD[ caspase—recrui tm ent 复旦大学2005弼博士毕业论文⑤TN F受体相关因子( TRAFs,TN F receptor-associ atedfactors) ;⑥REL( N F-KB)和IKB家族摄白质;⑦BAG 结构域( Bcl .2-associ atedathanogene dom ai ns.)” I】近年采囊一些TPR爨囊被擐福建快三技巧 —首页-参与了缨魏羯亡傣号途径,铡舞,CH IP是一+个含TPR基侉和u盒的鬣臼,它可以和H sc70和H sp70相互作嗣,后来发现它在某些类型的Parki nson瘸中调节神经细胞凋亡;这越因为在多巴胺能神经元中,Pael 受体的聚集会弓l 发细胞凋亡。而CH IP、H sp70、Parki n以及和Pael 受体形成一个高分予羹戆复合麓。提高复合物审CH IP的含曩,可使H sp70从Parki n和Pael 受体上解离,从而促进Parki n对Pael 受体的溅索化,降低Pael 受体累黛引起的细胞凋亡112J 。而最新的研究表明CH IP和可促使转录因子H SF.1的寡聚化秘激活,键避蒸傣克蛋耋薹豹表达麸瑟笈簿藏凋亡鲍佟瘸【i 3】;TPR2戴是一令含蠢J 结构域和TPR基序的蛋囱,其中TPR綦序能够和Rad9蛋自相曩作用,而Rad9是一个细胞周期蛋白,它通过和抗凋亡碾白Bcl 一2蛋白相互作用从而调控细胞凋亡途径,由_l 墩衷暖TPR2既可以调节细胞周期又可影响细胞凋亡信号途[ i 4, t5] ;Strap是一个禽6个串联瓣别TPR基净兹蛋自,在缁胞箍子压力靛条俘下Strap表达上调,凰与p53基因的转录共激活子复合物中的p300相互作用,从而调节M DM 2的活性,最终影响P53的稳定性并由此调节细胞凋亡【1“ 。在DN A损伤g【起戆疆亡臻譬逶路孛,ATM 是一令关键牲羲激酶,最近懿磅究袭明在基霾缝悉力下,PP5研以和ATM 发生相互作用,减少PP5的表达可以减少D N A损伤引起的ATM 激活,超表达失活的PP5突变体也可抑制ATM 底物磷酸化和ATM1981健丝氨酸蛉爨身磷酸化,袭明PP5在ATM 奔导的璃亡信号通路中发挥着重要舱痒矮旧。SG T( t he sm al lgl utam hl e.ri ch TPR。contai ni ng pm tei n) 又被称为U BP,是猩1998年以细小病毒的非缡构蛋白N Sl 为诱饵进行酵母双杂交筛到的一个蛋自【18l ,各懿静溺SG T戆霆源犍穰褰,箕巾人类戆SG T蛋骞会鸯三个事联重复豹TPR基序[ 18, 1明。已知的含TPR基序的鬻白质在生物界中广泛存在,包括几乎所有的真核细胞生物中,比如酵母,线虫,果蝇,哺乳动物甚至寄难虫中,他们在缨胞周瓣控制,蛋自葳掰叠,转录调羧,蛋自矮遮毒|鑫,缨憝凋亡,泛素蛋自懿体降解,激繁受体信号途径中发挥了重要作用[20, 21, 22, 23, 24]。SGT释强自质存在如此之广泛,加上已知的TPR蛋白质具宵如此多样生物学功能,这就意味着SG T具有某种尚未发现的生物学功能。魏裁繇逑TPR蛋白中的TPR结构域在蠲亡中瓣霪要{誊霜,凌这里我嬲设建SG T蛋臼同样具有促凋亡功能并用实验证实了这一推断,并且诚实其促凋亡怒Caspase依赖的,同时伴脊细胞色素C从线粒体释放到细胞浆中,是一种经典的线短薄姣藏戆凋亡售号途经。 材料与方法1.材料复旦大学2005儡博士毕业论文小牛血清、G 418、Li pofectam i neTMReagent、Tfi zol 、质粒pCD N A3和质粒pCDN A3.1-M yc.H i s为Invi trogen产品;质粒pSi l encer2,0一U 6为Am bi on公司产品;PVD F膜、抗G FP单克隆抗体为Roche公司产品;抗H sp60单克隆抗体为StressgenBi otechnol ogy公司产品;抗PARP单克隆抗体为Cal bi ochem 公司产品;抗细胞色素C多克隆抗体、Staurospori ne( STS) 购自Cel l辣根过氧化物酶标记的二抗均为Santa Cruz Bi otechnol ogy公司产品;各种限制性核酸内切酶、T4 DN A连接酶和随机引物探针标记试剂盒购自购自Takara公司。RPM I一1640培养基、DM EM 培养基、质粒小量抽提试剂盒、PM SF、Leupcpti n、H oechst33258和Cycl ohexi m i de( CH X) 为Si gm a- Al dri ch公司产品;N yl on膜( N+) ,a_32p—ATP购自Am ersham 公司;焦磷酸二乙酯( D EPC) 、B一巯基乙醇为Fl uka产品;十二烷基磺酸钠( SD S) 为Al l l esco产品;X光胶片为Kodak公司生产。ECL增强发光试剂盒为普菲公司产品;胶SM M C.7721/pcdna3由本实验室保存;其余试剂均为进口分装或国产分析纯Si gal i ng公司;2.仪器ABl 317全自动测序仪:PE公司。离心机为Eppendorf公司。PCR仪:PE公司。荧光显微镜:N i kon公司。流式细胞仪( FCM ) 为美国BECTO N —D ICK/SO N 公司产品。D N A、RN A电泳槽购自于华美公司。紫外交联仪为BIO --RAD 产品。细胞培养箱为Form a Sci enti fi c公司产品。杂交炉为Bi om ctTa公司产品。蛋白电泳装置为Am ersham Pharm aci a和BIO —RAD 公司产品。湿式转移装置为BIO —RAD 公司产品。凝胶成像装置:上海复日公司。4 3.PCR引物复旦人学2005届博士毕业论文1) Acti n引物:Sense Pri m er:5' - AACCG TG AAAAG ATG ACCCAG 一3’Anti sense Pri m er:5’一CTCCTG CTTG CTG ATCCACAr- 3’21 pcDN A3一SGT引物:Sense Pri m er:5’一G ATG A芦口TCA:rG G ACAACAAG AAG CG CC一3’Anti sense Pri m er:5’一G ATCTCG AG TCACTCCTG CTG G TC( 订℃一3’.3) pcDN A3.1/M yc—H i s( 一) A—SGT引物:Sense Pri m er:5’G ATG Ap汀TCATG G ACAACAAG AAG CG CC3’Anti sense Pri m er:5’CG G G ATCCCTCCTG CTG G TCG TCG TTG 3’41 si RN ASG T:Sense Pri m er:5' -GATCC△ £盟鱼丛鳗££鱼! 鱼g£! 坠TTCAAGAGATf kAG CCACG G CCTCCACG TG CTTTTTTG G AAA一3’Anti sensePri m er:5' - Ae℃TTTTCCAAAAAAG CACG TG G AG G CCG TG G Cl l ATCTCTrG AA TAAG CCACG G CCTCCACG TG.3’51 SG T F11.90:Sense Pri m er:5' - ATG AArTCATG G ACAACAAG AAG CG CC- 3。.Anti sense Pri m er:5’一AACTCG AG CTCTG CTG AG TCCTCCTCG G A一3’6、SG T F2 91—203:SensePri m er:5’AAG AATTCG CAG AG CG CCTCAAAACCG AA3’Anti sense Pri m er:5’TTCTCG AG CTCCG CTALTCTrG AG G TTG G A 3’71 SG T F3 202.313:Sense Pri m er:5’ArG AATTCG AG CTG AAG CTG CG G G AG G CC 3’Anti sense Pri m er:5’( 1芦J CTCG AG TCACTCCTG CTG G TCG TC 3’8、SG T F41—203:Sense Pri m er:Anti sense Pri m er:5’ 衄C丁CGAGCTCCGCTATCTTGAGGTrGGA3’5' - G ATG AATTCATG G ACAACAAG AAG CG CC.3’以上由上海生工生物工程有限公司合成。 4.方法( 1) 质粒构建复旦大学2005届博士毕业论文大肠杆菌E.Col iTopl 0感受态细胞的制各1) 挑取LB固体培养基上生长的E.Col i 单菌落,接种于2.5 m l LB液体培养基中,37℃恒温,220rpm 振荡培养过夜( 约12—14hr) 。2) 取O .5 m l 新鲜培养菌液,接于50 m lLB,37℃振荡培养至O D600=0.2—0.3。3) 收集菌液,4。C离心5000 rpm x5 m i n,沉淀物重悬于预冷的20m 1100m MCaCl 2冰浴20m i n。4) 4。C离心5000 rpm × 5 m i n,弃上清。5) 加预冷的1—2 m l感受态细胞,可立即转化:亦可用等体积预冷的无菌10%甘油一100m MCaCl 2重悬4中沉淀的感受态细胞,分装100—200/zl /管,保存于_80℃备用( 6个月左右) 。100 m MCaCh吹打重悬沉淀,继续冰浴3hr后即为连接产物Catl 2方法转化E.col i Topl 0感受态细胞1) 取5m 连接反应混合物,混合于100—200u l 感受态细胞,冰浴45 m i n一211r。2) 42。C热休克120see,迅速转移至冰浴。3) 加入500 tl l 新鲜LB培养液,于37。C缓摇孵育45—60m i n。4) 将转化的细胞涂布LB固体培养板( 含抗生素Am p) ,37。C倒置培养过夜。碱裂解法少量制各细菌质粒DN A1) 挑取LB固体培养基上生长的E.col i 单菌落,接种于2.0m l LB液体培养基中,37。C恒温230rpm 振荡培养过夜L约12—14hr) 。2) 取1.5 m l 新鲜过夜菌,室温离心12000 rpm x20 sec,尽弃上清。‘。3) 将沉淀细菌振荡悬浮于100#1溶液I。( 溶液I:50m M 葡萄糖;25m MTri s—C1;10rnMED TA, pH 8.o) 复旦大学2005届博士毕业论文A.2.0 MTri s-Cl ,pH 8.0B.0.4MED TA,pH 8.0C.G l ucoseD .ddH 206.25 m12.50m4.730guD to500 m4) 加200#1新鲜配制的溶液Ⅱ,倒置数次混匀。( 溶液II:0.2 M N aO H ;1%SD S)5) 加入150#1预冷的溶液IⅡ,振荡混匀;4*0离心12000rpm x5 m i n,弃沉淀。( 溶液III:KAc缓冲液,3.0M K+,5.0M Ac.)6) 上清加入450#1的苯酚:氯仿:异戊醇( 25:24:1) ,振荡混匀,4。C离心12000rpm x5m i n。7) 取上层水相,加O .9m l 预冷无水乙醇,倒置数次振荡混匀,4。C离心12000rpm xl 0 m i n,将沉淀D N A用70%乙醇洗一次,37℃烘箱干燥D N A。8) D N A重溶于20#i TE缓冲液( 台KN ase 10-20#g) ,37。C水浴1—10rai n后进一步酶切分析或保存于一20℃。( TE缓冲液:l O m MTri s—C1;l m MED TA)7 复旦大学2005届博士毕业论文A.Tri s1.21gB.ED TAN a2—2H 20O .37gC ddH 20800.0m lD.1.0 MH CI调pH 至所需E.ddH 201000.0 m l质粒D N A酶切鉴定1) 酶切反应如下D N A( O .2-2J Ytgl 川)10× Buf f er2.O 川2.0 uIEnzym e 1( 10- 20u,川) O .5¨ IEnzym e 2( 10- 20u九d) O .5川ddH 20Total10.0川15.O 川2) 20u1酶反应体积,37。C消化2h,并进行DN A琼脂糖电泳后回收。G el Extract Ki t( 华舜) 回收I) N A片断1) 割下含目的片断的琼脂糖凝胶块,放入1.5m l Eppendorf管中。按照每100m g琼脂糖加入300u 1S1液的比例加入Sl 液,55。C水浴10分钟,使琼脂糖完全溶解,每隔2分钟颠倒混匀一次。21若D AN 片断小于500bp,加入1/3体积的异丙醇,混匀,55℃水浴1分钟。3) 将溶化的琼脂糖液移入吸附柱中,静置1分钟,100009离心15秒,倒掉I发集管中液体,将吸附柱放入同一收集管中。41在吸附柱柱中加入500“ l W l 液,静置1分钟,100009离心15秒,倒掉收集管中的液体,再将吸附柱放入同一收集管中,100009离心1分钟。5) 将吸附柱放入一干净的1.5 m l Eppendorf管中,在吸附柱中央加入30u1Tl 液,静置1分钟后,100009离心1分钟,将回收目的片段贮存于一200C备用。 复旦大学2005届博士毕业论文Si gm aG eneEl ute Pasm i dM i ni prepki t抽取细菌质粒1) 120009× l m i n离心收集l ~5m l 过夜培养细菌。2) 加入200u l3) 往重悬的菌液中加入200,振荡或吹打,彻底重悬细菌。,迅速温和颠倒离心管u l6~8次。4) 加入350u1,温和颠倒4~6次,120009× l O m i n5) 往中加入500ul Col um n,离心120009× l m i n6) 加入500l a 1,120009× 30sec,弃去液体( 本步骤仅用于EndA+,如Topl 0)7) 吸附柱中加入750加任何洗涤液,以最大速度在离心2m i n。8) 将吸附柱移入新的H1,120009× l m i n,弃去液体,不中,加入i 00uI,120009Xl m i n9) 所得质粒DN A可立即使用,或储存于--20℃。( 2) 细胞培养和转染SM M C一7721、SG T/SM M C.7721和pCD N A3/SM M C.7721细胞在37℃、5%C02浓度下培养于含10%d、牛血清的RPM l l 640培养液中。CO S,1细胞在37℃、5%C02浓度下培养于含l O %dx牛血清的DM EM 培养液中生长;基因转染参照Li pofectAM IN E转染试剂盒操作手册。1) 将处于对数生长期的细胞以1× 105细胞i l l 接种于六孔细胞培养板中,培养16~24h,细胞密度约60.80%时2) 配置转染试剂:A试剂:l #g质粒+100#1无血清无双抗的1640培养基,B试剂:5[m stCrrl sv]l Li pofectam i ne+100[m storl sv]l 无血清无双抗的1640培养基。3) 将A试剂和B试剂小心混匀,室温静置30.45m i n,以形成DN A一脂质体复合物。4) 弃去培养孔中培液,用2m l 无血清无双抗的RPM l l 640培养基洗涤细胞两次。5) 在D N A一脂质体复合物中加入800[ m stoqsv】l 无血清无双抗的 复旦大学2005届博士毕业论文RPM l l 640培养基,小心混匀,共1.0m l 加入一个培养孔中。6) 37。C,5%C02培养5h,再加入1.0m l 含20%血清的培养基,37。C,5%C02培养24 h,更换新鲜完全培养液继续培养。( 3) 多聚酶链反应( PCR) 扩增目的cD N A片断1) PCR反应体系如下Tem pl at e1 0× Buff:erPr- m erPr- m er 2dN TP( 10m m )H ,OTaq Enzym eTot aI1 LLI5uI1 LLl11 LLI1uI36山1rtl ( 2U )50山2) PCR条件95。C,3m i n,其循环条件为946C共30个循环,最后72。C延伸10rai n。30sec,56。C 30sec,72。C70sec,( 4) 逆转录PCR( RT- PCR)1) 按下列组成配制反转录反应液。M 口Ck10x FrrBufferRN ase Free dH 20dN TPM i xture( 备10 raM ):费N ase InN bRorAM 、,Reve啪TranscdDtaseRandom9m ers或O l i go dT- AdaptorPri m er或特异牲下游目l 翱实验样品RN A《《1蛔total RN A)TotaI、IJ2羽1卅3,75 H |1棚0.25Il }0.5划0。5州1卅,OH 鹏am pl e2) 按以下条件进行反转录反应。 复旦大学2005届博士毕业论文3) 按下列组成配制PCR反应液。4) 把上述反应液加入到反转录结束后的PCR反应管中,轻轻混匀。按以下条件进行PCR反应5) 反应结束后,取反应液进行琼脂糖凝胶电泳。《5) H oechst染色H oechst33258储存液:称取H oechst33258试剂l m g,用20m l 蒸馏水溶解后,滤过,4"C避光保存。用时蒸馏水10倍稀释为染色液。细胞固定液:4%多聚甲醛1) 细胞生长在24孔板中或覆有盖玻片的6孔板中;2) 4%多聚甲醛室温固定30m i ra3)用含0.5%Tri ton—X 100 PBS室温处理20m i n;4) H oechst33258染色液室温染色5~10m i n;5) 封片后荧光显微镜下观察比计数。 ( 6) 分离细胞线粒体组分复旦大学2005届博士毕业论文CFS缓冲液:10 m MH EPES—N aO H0H7.2),0.22Mm arm i toI,68m Msucrose,2m M N aCl .2.5 m IVl KH 2P04,O .5 m MEG TA,2m IVlM gCl 2,5m MSO di umpyruvate,0.1m Mphenyl m ethyl sul phonylfl uori de and 1 m M di thi othrei tol6) 细胞用PBS洗一次,用CFS缓冲液重悬细胞;7) 重悬的细胞用22号针头来回抽10~12次以裂解细胞;8) 匀浆产物750Xg离心5 m i n,去沉淀留上清;9) 上清10,000× g离心10m i n,沉淀为富含线粒体的组分,上清为胞浆组分;10) 沉淀加入1× SD S蛋白上样缓冲液,100℃加热3rai n后上样或一20℃保存。( 7) 流式细胞术细胞碘化丙啶口D染色及流式细胞仪ffCM ) N 定按我室已发表的方法进行。细胞O .25%胰酶消化后用PBS洗涤,离心去上清,75%酒精固定过夜。加10m MPBS( pH 7.4) 洗涤后,用i %Tri ton X一100处理10m i n,然后0.1m g/m l RN A酶37℃消化10m i n,最后用20/zg,/m l 碘化丙啶( PD染色,FCM 测定。( 8) N orthernBl ot细胞总RN A的提取1) 依照Tri zol 试剂的说明书进行。单层培养细胞加入l m l微量移液器将裂解液移至微量离心管中;2) 室温放置10—15m i n,加入O .2m l 三氯甲烷,剧烈振荡后置室温5m i n:3) 4"C,12,000Xg离心15m i n,上清加入O .5m l 异丙醇,室温沉淀15—30m i n;4) 4℃,12,000Xg再离心15m i n,沉淀用70%乙醇洗涤后,干燥并用适量DEPC水溶解,紫外定量,一70℃存放备用。Tri zol 试剂,l m lRN A甲醛交性凝胶电泳转膜5) 制备100 m l 甲醛变性琼脂糖凝胶:琼脂糖19,10× RN A电泳缓冲液10m l ,37%甲醛18m l ,D EPC处理水72m l 。RN A30/l g,D EPC处理水13m ,10XRN A电泳缓冲液4/zl ,100%甲酰胺20m ,37%甲醛7#1,65℃变性15m i n,加O .4%溴酚兰载6) RN A样品处理:样缓冲液2-3/xl 和适量溴乙啶( EB) 。 复旦大学2005届博士毕业论文7) 电泳:加样后于60伏电泳3h,电泳结束后,取下凝胶,紫外灯下观察。电泳缓冲液为1× RN A电泳缓冲液,加样前将凝胶预电泳10m i n,转膜8) 凝胶用20xSSC缓冲液浸泡1 5m i n。9) 将凝胶置铺有滤纸的平台上,滤纸的两端浸于20xSSC缓冲液中,为防止短路,凝胶上覆盖和胶同样大小的N yl on膜,赶尽气泡,再在膜的上方置两层W hatm arm3M M 滤纸,其上方置约10cm 厚的吸水纸,用玻璃平板盖压,上置5009左右的重物,室温转移18—24h,并不断更换湿的纸巾10) 转移结束后,取下N yl on膜,在uv灯下用铅笔标上18S和28S带的位置,将N yl on膜正面( 有RN A面) 向上,uv固定( 1500kJ ,l m i n) ,固定好的膜置4保存备用。11) 10× RN A电泳缓冲液:O .2m ol /L P04。,50m m ol /L乙酸钠,10m m ol /LED TA,pH 7.0。12) 20xSSC转膜液( pH 7.O ) :3m ol /LN aCl ,O .3m ol /L柠檬酸三钠。探针标记13) 在微量离心管中配制下列反应液。95"C加热3分钟后迅速置于冰中冷却放置5分钟:14) 将上述产物与下列反应成分混合37。C反应10m i n。dG TP( 1.5m m 01)dCTP( 1.5m m 01)2.5川2.5川dTTP( 1.5m m oI)2.5山Label i ng10× Buf f erKl enowFragm ent2.5山1.0山cp” p- dATP2.5 LdTotal13.5td 复旦大学2005届博士毕业论文15) 65*C力N 热5分钟使酶失活( 或者加入EDTA使其终浓度为30 raM )。16) 95。C力N 热3分钟后迅速置于冰中冷却。17) 取适量的反应液直接作为探针使用。杂交18) N yl on膜放入杂交管中,膜反面紧贴杂交管壁,加入8m l 杂交液,65。C预杂交4h,倒掉预杂交液,加入3m l 杂交液和标记探针,65。C杂交20h。杂交完成后,倒掉杂交液,用洗膜液65℃洗膜3-5次,每次30m i n,一70℃压片后放射自显影。19) 从尼龙膜上去除探针:将杂交后的尼龙膜浸入洗涤液中,煮沸10m i n,于室温将尼龙膜干燥,4。C存放或用于再次杂交。O .2M 磷酸缓冲液,pH 7.2,含IM mEDTA,l %W /V) BSA,7%( w /v) SDS,15%甲酰胺。21) 洗膜液:40m M 磷酸缓冲液,pH 7.2,含有l m MEDTA,I%( W /V) SDS。22) 去除探针液:10m m 01/L Tri s—C1,l m m oU L20)杂交液:ED TA,pH 7.2,0.1%(w /v)si )s。( 9) W esternBl ot细胞裂解液:50m M Tri s.HCI(PH=8.o);150m M N aCl ;0.02%叠氮钠;0.I%SDS;100腭/m l PM SF;1p g/m l Aproti ni n;I%N P一40( N oni det P一40);0.5%去氧胆酸钠。2XSDS上样缓冲液:100m M Tri s—H Cl ,PH =6.8:200raM DTT;4%SDS;O .2%溴酚蓝;20%甘油。1X电泳缓冲液:25m MTri s;0.25M 甘氨酸:0,1%SDS。TTBS:150m MN aCl ,10m M Tri s1) 裂解细胞细胞用l m l PBS冲洗两次。再加入l m l PBS( PH =7.4) ,用细胞刮刀刮下细胞,收集细胞悬液于Eppendorf管中。4"C500 g离心5m i n。尽弃上清,加入60u 1细胞裂解液,吹打均匀。2) SD S.PAG E取30~50冲液,100。C煮沸5m i n,冰浴5m i n,于1 x电泳缓冲液中进行SD S聚丙烯酰胺凝胶电泳约2~3h。H Cl PH 8.0,0.1%Tw een-20。ug蛋白裂解液,加入等体积的2× SD S上样缓 复星大学2005嚣博士毕韭论文3) 转膜将胶剥下,做好上样标记及样品正、反硒,浸于转膜缓液中( 3.039Tri s;14,29甘氨酸;150m l 甲醇;加水至1000m 1) 15rai n。剪6张与胶同样大小的3M 滤纸,浸予转膜缓冲滚审。再剪一张与驳同样大小麴PVDF膜,先用举醇瀑润后浸予转膜缓冲液中。在转印仪的阳极和阴极之闯,依次放置3张滤纸、膜、胶、3张滤纸。恒流350m A( 约100V) ,转膜60m i n。4) 染色转膜结束后,将PAG E胶没予丽春红染波中( 450m l 甲醇;100m l 冰酪酸;O 。259考马聚嶷蓝R250;嬲永至t000m 1) ,囊察转袋壤况,秽螽去离子水洗去残留的黼春红。5) 封闭将转移好的PVD F膜放置于25m l 封闭液( 150m MN aCl ,tom MH CIPH 8。0,0。1%Tw een一20,5%N 疆牛娆) 审,4。C鸷阙过夜。6) 加抗体弃去封闭液,加入一抗抗体室温或37℃孵育2小时。TTBS( 150m MN aCl ,10m M Tfi sH Cl PH 8.0,0.1%Tw een。20) ,15分钟洗Tri s3次。热入辣粳过氧纯戆辩标记麓二获,374C孵育1小时。TTBS,15m i n洗3次。7) 化学发光ECL化学发光系统检测。压片,冲片。《10) RN Ai发夹样si RN A模板设计将文献报福建快三技巧 —首页-的si RN A靶序列输入下列网页文本框中,阐页随后将其转变成所要设计的模板正义和反义链。§ 秘;』』型壁坠§ 擞§ iQ壁:£Q蛰丛魃歉lib』堡i§ £』蝥§ 鲢£瑟£墅』Q墅!墼l£墨塾熊! 复巨大学2005届博士毕业论文Fi gure1.Incl ude an addi ti onal G C basepai rat thi sposi ti on onl yi f the dow nstreambase on thetop strand( the+1 posi ti onof thesi RN A) i sa T or aC:i f the+lposi ti oni s aGor al l A,as i t i s i n thi sexam pl e sequence, donot i ncl ude i t.Thepurposeofthi saddi ti onal basepai ri s toprovi dea G or an A resi due as the fi rst nucl eoti de of thesi RN Atranscri pt because RN ApolH Iprefersto i ni ti atetranscri pti onw i th apuri ne,thus i thel psto faci l i tate effi ci enttranscri pti on.N ote,thi saddi ti onal nucl eoti de w i l lnot becom pl em entaryto ei ther thetargetm RN Aor the anti sense strand of thehai rpi nsi RN A.Thi s extra nucl eoti de i n the sense strandappearsto have no effecton theacti vi tyofthehai rpi nsi RN A..将发夹样si RN A克隆至pSi l encer载体1) 将寡核苷酸溶于无核酸酶水中,终浓度为1 ug/m l2) 如下配置退火反应混合物;Am ount2 ul2 m46plCom ponentsensc fi RN Atem pl ate ol i gonucl eoti d£anti sensc si RN Atem pl ate ol i gonucl eotl de1X D N AAnneal i ngSol uti on31 90。c) j n热3m i n,冷至37。C孵育1小时6 复旦大学2005届博士毕业论文4) 退火后的si RN A模板可直接用来连接后存于一20。C;5) 用5u l si RN A模板加入45 u 1无核酸酶水中稀释至终浓度为8 ng/m l ;6) pSi l encer载体( Fi gure 1) Bam H I和H i ndIII酶切回收后备用,如下设立连接反应( 含一个阴性对照) ;pl us- l nsert1plm i nus—i nsert Com ponent一——di l uted anneal ed si RN A i nsertIX£吐媳Anneal i ngSol uti on6癣1pl10XT4 D N ALi gaseBufferl 醛IpS//encm "vector1plT4DN Al ;黟躺e箨u/p1)一一1鼙l6pl1驭Ifl ucl ease—free w ater1弘l1pl7) 连接过夜后,常规转化,挑取克隆测序验证;8) 将特异性的si RN A载体和对照载体常规方法分别转入哺乳动物细胞鉴定其抑制效果。 结果复旦』:=学2005届博士毕业论文1.SM M C.7721细胞超表达SG T促进化学药物引起的细胞凋亡SG T作为一个TPR蛋白,在其肽段的中央有三个串连重复的TPR基序( Fi gure21。Fi gure2.Schem ati cdi agramof SG T:H um an SG Tn1SG T) i s com posedof 313 am i noaci ds and show s asl i ght enri chm ent i n the am i no aci dgl utam i neat the C term i nusw here 13 out of 50 am i noaci d;ThreeTPR m oti fsare l ocated i n the center of thepol ypepti dechai n.自发现以来一系列其相互作用蛋白被相继鉴定,但是其生物学功能仍知之甚少。而已知的TPR蛋白比如CH IP, TPR2和Strap蛋白均可调节细胞凋亡过程,我们因此推测其是否也在凋亡信号途径中也有一定的作用。为此,我们首先将PCD N A3.SG T转入SM M C一7721细胞,G 418筛选4周后,收取细胞提m RN A进行N orthern印迹鉴定,结果表明我们成功构建了SG T超表达的SM M C- 7721稳转细胞株( Fi gure3A) 。接下来我们用此细胞株来验证SG T是否在细胞凋亡中发挥作用。首先,用CH X处理细胞,分别在oh、24h经H oechst33258染色,可以发现超表达SG T的细胞株呈现出凋亡的经典特征,即出现核碎裂、核浓缩,与此相对应的SM M C一7721细胞却几乎很少有核碎裂现象出现,因此可初步推断超表达sG T可促进sM M C一7721细胞凋亡( Fi gure3B) 。 复旦大学2005届博士毕业论文Fi gure 3.Ecotopi c expressi onof SG Tprom otes apoptosi si n SM M C一7721cel l s.(A)SM M C一7721( SM M C一7721/SG T) .Total RN A( 30脚fromm ockSM M C一7721/SG Tcel l s( 1ane SG T) w ere extracted andsubj ectedto N orthem bl otanal ysi s.(N ote:the exogenousSG T m RN A i s 941bp,the endogenous SG T m RN A i sIdenti fi cati onofstabl ecel ll i nesexpressi ngpcD N A3.0- SG Tcel l s( 1ane M ock) and2.4kb) .G APD Hw as used as an i nternal contr01.( B) SM M C一7721 cel l s,m ock cel l s(stabl ecel l l i nesexpressi ng pcDN A3.O 、andstabl e SM M C一7721 cel l l i nesexpressi ngpcD N A3.0一SG T( SM M C- 7721/SG T) w eretreatedrespecti vel y w i thCH X( 10#g/m )for 24hours,thencel l s w ere fi xed and stai ned w i th H oechst 33258.Theapoptofi ccel l s w ere countedbyfl uorescencem i croscopy.2.SM M C.7721细胞凋亡过程中SG T的m RN A表达水平升高既然外源性的SG T可以引起细胞凋亡,那么内源性的SG T是否也参与细胞凋亡过程呢?为了验证此假设,我们来检测细胞在凋亡的过程中SG T的表达是否发生改变。SM M C.7721和SM M C一7721/SG T细胞分别用CH X和STS处理,CH X处理后在0小时、12小时、24小时、36小时和48小时收细胞,STS处理后则在0小时、2小时、3小时、4小时、5小时和6小时收细胞,结果发现SG Tm RN A在CH X处理后12小时达到最高峰,为为处理前的将近两倍左右;STS处理后SG T m RN A在2小时后达到高峰,为处理前的约2.5倍。不仅如此,而且SG T m RN A的升高在细胞出现明显的凋亡特征之前( CH X处理后24小时出现大量的细胞凋亡( Fi gure 4B) ,STS处理后3- - 4小时才出现大量的细胞凋亡( Fi gure4A) ) ,进一步表明SG T是很有可能参与细胞凋亡信号途径。 复旦大学2005届博士毕业论文Fi gure4.The m RN A l evel of SG T i supregul atedw hen cel l s underw ent apoptosi s.After exposureof SM M C一772 1 cel l s toSTS( panel A) or CH X0anel B) for thei ndi catedti m e,totalRN Aw as i sol ated fromSM M C一7721 cel l s,0.5/zgRN A w as usedtoperf ormRT- PCRanal ysi s to assess the l evel of SG T m RN A,acti nw as used as ai nternalcontr01.Resul ts quanti tated bydensi tom etri c anal ysi sarerepresentati veofthreerepeated experi m ents.3.RN A干扰下调内源SG T的表达可抑制CH X诱发的SM M C.7721细胞凋亡SG T m RN A在SM M C一7721细胞凋亡过程中升高表明其与凋亡有一定的相关性,但并不表明其一定可以调节细胞凋亡信号途径。为了更进一步验证前面的猜想,我们用RN Ai 技术抑制内源性SG T的表达来进一步验证我们的设想。首先在CO S一1细胞中转入针对SG T的特异性的si I斟A、对照的si RN A和pcD N A3.1.M yc—SG T质粒,然后用针对M yc标签的抗体W esternBl ot检测,结果显示设计的si RN A能够有效地下调外源性的SG T在CO S—l 细胞中的表达,下调的比例近90%( Fi gure 5A) :接下来探讨其对内源性的SG T是否也能有效地抑制 复旦大学2005届博士毕业论文其表达呢?在SM M C一7721细胞中同样转入针对SG T的特异性的si RN A、对照的si RN A,收取相应的总RN A,接下来的RT- PCR结果表明此si RN A亦能将内源性SG Tm RN A水平下调约70%( Fi gure 5B) 。将上述转入两种si RN A质粒的细胞用CH X处理18小时,H oechst33258染色后荧光显微镜下计数凋亡细胞,统计结果显示当SG T的表达下调后,发生凋亡的细胞数目也与对照下降了约60%(Fi gure 5c) ,有力的说明内源性的SG T也在凋亡信号中有一定的调节作用。Fi gure5.TheendogenousSG T i s associ ated w i thapoptosi s.PanelA:Knockdow n ofSG T byRN A i nterference.ThepcDN A3.1/m yc· Hi s(· 1A- SG T and pEG FPw erecotransfected to CO S- 1 cel l s w i th m ockpSi l encer vector( 1ane M ock) orsi RN A SG T(1ane si RN A) ,thentheexpressi onof SG Tw as detectedbyW esternbl ot w i thanti —m ycanti body.W esterntransfecti oneffi ci ency.Panel( si RN A) w ere,respecti vel ytransfeeted to SM M C- 7721 cel l s,the l evel of SG Tm RN AW as anal yzed by RT-PCR.PanelC:Suppressi on of endogenous SG T decreasedapoptosi sofSM M C一7721 cel l s.The m ockpSi l encer vector(1eft panel :M :ri ght panel :M ock) orsi RN ASG T( 1eftpanel :S;ri ghttransfected toSM M C一7721cel l s,48h aftertransfecti on,cel l sw ere treated w i th STSfor 6 h.then cel l s w ere fi xed and stai ned w i m H oechst 33258.Theapoptoti c cel l sbl otfor G FP W as used asa controlforequalprotei nandB:the m ockpSi l eneervector rM ock) or si RN A SG Tpanel :si RN A) w ere,respecti vel y,w ere countedbyfl uorescencem i croscopy.Representati ve resul ts( m eans士S.D.) from21 复旦大学2005届博士毕业论文one out ofthree i ndependent experi m entsarepresented( ri ght panel )4.TPR基序为SG T促细胞凋亡活性所必要迄今为止,已知的TPR蛋白中的TPR基序在其发挥生物学功能方面有着不可或缺的作用,其中CH IP、TPR2和Strap这些在凋亡信号途径中起着调节作用的TPR蛋白质,其TPR基序对他们的促凋亡活性是必要的。因此我们解下来探讨SG T蛋白的TPR基序是否也同样重要呢?我们根据SG T的结构特点构建了四个缺失突变体,其中最短的一段仅包括其三个串连排列的TPR基序和他C端的几个氨基酸残基,将全长、缺失突变体和对照质粒转入SM M C一7721细胞,H oechst 33258染色显示与全长相比,凡是转入能够表达具有TPR基序的质粒其促凋亡活性就与全长的SG T相当( Fi gure 6) 。由此表明,TPR基序对于SG T的促凋亡活性是必要的。 复旦大学2005届博士毕业论文Fi gure 6.TPR m oti fsarei m portantfortheapoptoti cacti vi tyofSG T.( A)SM 匝dC一7721 cel l s w ere transfected w i th aseri es ofdel eti on m utants show n i n031.24h after transfecti on,cel l s w ere fi xed and stai ned w i th H oechst33258.Then,theapoptoti ccel l s w ere countedbyfl uorescence m i croscopy.Representati ve resul ts( m earl s± S.D.) fromone out of fouri ndependent experi m entsSchem ati c di agramof SG T and i ts m utants.SG T contai ns three TPR m oti fsarepresented.03)asi ndi cated.5.超表达SG T不影响细胞增殖和细胞周期进程...

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